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細胞劃痕實驗新方法-----傷口愈合實驗

日期:2022-04-18瀏覽:3897次

傷口愈合實驗的這個關鍵步驟,你掌握了嗎?

 

傷口愈合實驗是體外研究細胞遷移非常重要的實驗。原理是人為的在鋪板的單層細胞中制造一個空白的無細胞的地帶,然后對這個無細胞地帶的邊緣的細胞進行觀察;這些邊緣的細胞會開始進行遷移活動,并且覆蓋整個無細胞的區(qū)域,重新互相接觸在一起。本研究中用到傷口愈合的實驗,使用TARBP2和pri-miR130b共表達,通過對傷口愈合的速度的影響,得出TARBP2-K52R可以*抑制pri-miR130b對傷口愈合過程的影響。

 

在文中,使用Ibidi的傷口愈合插件進行了傷口愈合實驗。這是一種雙孔的硅膠插件,可以放在培養(yǎng)皿中,插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將細胞種在插件中,等待細胞貼壁長滿后,將插件移除,這樣,兩孔間的縫隙就是一個無細胞的500μm“劃痕"。

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                圖1  使用ibidi Culture-Insert 2 Well進行傷口愈合測定的實驗工作流程

 

1.實驗材料

1) 細胞:    serum starved A549luc stable cell line

2) 實驗耗材:   傷口愈合插件培養(yǎng)皿 (ibidi, 81176)

3) 細胞培養(yǎng)基:  DMEM   (Hyclone)

4) 試劑:  Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

5) 滅菌鑷子

6)倒置顯微鏡,最好具有自動圖像采集系統(tǒng)和用于活細胞成像的頂部培養(yǎng)箱

2.實驗步驟

步驟1:鋪細胞(圖二)

1.將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護膠帶撕除。

2.在ibidi細胞插件的每孔中加入70μl 3x10 5的細胞懸液。注意不要大力晃動培養(yǎng)皿。以防止細胞不均勻。

3.將細胞在37°C和5%CO2下孵育至少24小時

 image.png

                  圖2   A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細胞。

 

步驟2:形成“劃痕"

1.采用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24小時

2.如圖三所示,小心的用鑷子夾住插件的一個角,將插件移除。

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                                 圖3   使用無菌鑷子移除ibidi 插件

 

3.移除插件后,要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕"。

4.小心的用無細胞培養(yǎng)基或PBS清洗細胞,之后加入2ml培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。


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                           圖4   由ibidi插件移除產(chǎn)生無細胞500μm的縫隙

步驟3:采集顯微圖像分析

1.在顯微鏡下選取能同時看到“劃痕"和兩邊細胞的視野進行成像,“劃痕"的方向比較好是水平或者垂直。

2.采集0h和10h的圖像,并且分析每張圖的細胞覆蓋劃痕區(qū)的面積。


3.實驗結(jié)果

image.png

如圖所示,共表達pri-miR130b和TARBP2-WT(miR130b-WT)比單獨表達pri-miR130b(miR130b-con)對細胞遷移更有抑制作用,而將pri-miR130b和TARBP2-K52R(miR130b-K52R)共表達對于細胞遷移基本沒有抑制作用了。


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